Im März 1805, etwa sieben Monate nach seiner Rückkehr aus Amerika, bricht Humboldt in Paris zu einer Reise nach Italien auf. Begleitet wird er von dem Chemiker Joseph-Louis Gay-Lussac und dem Geographen Franz August O’Etzel. Die Route führt über mehrere Stationen zunächst nach Rom, wo Humboldts Bruder Wilhelm Preußischer Gesandter ist, und wo sich auch der Geologe Leopold von Buch zu der kleinen Reisegruppe gesellt. Humboldts Aufzeichnungen aus dieser Zeit, eingebunden in die Bände II und VI der Amerikanischen Reisetagebücher, spiegeln die Vielseitigkeit Humboldt’scher Wissenschaft. In römischen Museen und weiteren Kunstsammlungen vergleicht Humboldt die Erzeugnisse indigener Kulturen, die er in Südamerika kennengelernt hatte, mit jenen der klassischen europäischen Antike. Im weiteren Verlauf dient die Reise unter anderem vergleichenden vulkanologischen Untersuchungen, einschließlich der Besteigung des Vesuvs und der Beobachtung seines Ausbruchs im August 1805. Wiederholt führen Humboldt und Gay-Lussac chemische Untersuchungen des Meerwassers sowie zur Zusammensetzung der Atmosphäre durch, die noch im selben Jahr veröffentlicht werden. Ebenso versuchen die Forscher, den Einfluss verschiedener Gesteine auf den Erdmagnetismus zu klären. Über Neapel und Rom geht es Mitte September zurück nach Berlin, wo Humboldt am 16. November 1805 nach mehr als neunjähriger Abwesenheit eintrifft.